proteinslides Ni-NTA或Cu-NTA表面

應(yīng)用說(shuō)明： 

蛋白質(zhì)分子僅通過(guò)具有受控方向的poly-His標(biāo)簽連接到表面，否則將盡可能遠(yuǎn)離表面。這確保了天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)活性。無(wú)需樣品預(yù)純化。

圖1.零背景Cu2 +表面由束縛在高密度PEG涂層上的螯合Cu2 +離子組成。蛋白質(zhì)分子通過(guò)多組氨酸標(biāo)簽特異性連接。

重組蛋白通常與聚組氨酸（His）標(biāo)簽一起產(chǎn)生，以促進(jìn)純化。這些蛋白質(zhì)現(xiàn)在用于蛋白質(zhì)微陣列的制造中。為了利用poly-His標(biāo)簽的可利用性，我們基于零背景PEG涂層開發(fā)了一種螯合的Cu2 +表面，如圖1所示。該表面的使用基本上省去了純化步驟，并將其直接摻入了蛋白質(zhì)固定化過(guò)程，即可以將粗裂解物直接用于微陣列制造，如圖2所示的綠色熒光蛋白（GFP）。除了N末端或C末端的多組氨酸標(biāo)簽外，由于PEG環(huán)境的排斥性，每個(gè)固定的蛋白質(zhì)分子都遠(yuǎn)離表面并使其與表面的相互作用小化。結(jié)果是，對(duì)蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的干擾小?；瘜W(xué)環(huán)境的惰性和可控的取向都為固定的蛋白質(zhì)分子保留其天然構(gòu)象和活性提供了理想的環(huán)境，如圖3所示。對(duì)于6xHis標(biāo)記的磺基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶，可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面，其活性與溶液相幾乎相同。為了進(jìn)行比較，以無(wú)規(guī)取向固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷（γ-APS）涂層表面上的酶僅顯示約10％的活性?；瘜W(xué)環(huán)境的惰性和可控的取向都為固定的蛋白質(zhì)分子保留其天然構(gòu)象和活性提供了理想的環(huán)境，如圖3所示。對(duì)于6xHis標(biāo)記的磺基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶，可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面，其活性與溶液相幾乎相同。為了進(jìn)行比較，以無(wú)規(guī)取向固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷（γ-APS）涂層表面上的酶僅顯示約10％的活性?；瘜W(xué)環(huán)境的惰性和可控的取向都為固定的蛋白質(zhì)分子保留其天然構(gòu)象和活性提供了理想的環(huán)境，如圖3所示。對(duì)于6xHis標(biāo)記的磺基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶，可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面，其活性與溶液相幾乎相同。為了進(jìn)行比較，以無(wú)規(guī)取向固定在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（γ-APS）涂層表面上的酶僅顯示約10％的活性。

圖3.溶液相中酶活性與在γ-APS表面上隨機(jī)取向或在Cu2 + / PEG表面上受控取向的酶活性的比較。	圖2.左側(cè)顯示了吸附在螯合的Cu2 + / PEG表面的6xHis標(biāo)簽的GFP的固有熒光。該表面可抵抗沒(méi)有His標(biāo)簽的GFP的非特異性吸附（右）。光斑直徑約0.2毫米。

Cu2 + / PEG表面上的排斥性2D化學(xué)環(huán)境不僅對(duì)固定化蛋白分子的活性至關(guān)重要，而且對(duì)維持和恢復(fù)這種活性也至關(guān)重要。后者在固定在三個(gè)不同表面上的6xHis-GFP變性和重新折疊的重復(fù)循環(huán)后的熒光顯微鏡圖像中得到證明（圖4）：（a）Cu2 + / PEG表面；（b）Cu 2+離子螯合在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（gama-APS）功能化表面的表面亞氨基二乙酸基團(tuán)上；（c）用于非特異性蛋白質(zhì)吸附的γ-APS表面。盡管免疫染色顯示相似量的GFP，但三個(gè)表面的固有熒光強(qiáng)度卻有很大差異。Cu2 + / gamma-APS或gamma-APS表面的熒光強(qiáng)度為70％或< Cu 2+ / PEG表面的20％。盡管在變性步驟之后所有三個(gè)表面上均未檢測(cè)到熒光，但重新折疊的結(jié)果是表面化學(xué)性質(zhì)的強(qiáng)函數(shù)。在Cu2 + / PEG表面上，大多數(shù)熒光強(qiáng)度在重折疊步驟后得以恢復(fù)。相反，Cu2 + /γ-APS或γ-APS表面幾乎沒(méi)有熒光強(qiáng)度。在Cu2 + / PEG表面上，每個(gè)固定的GFP分子僅通過(guò)6xHis標(biāo)簽連接，但由于PEG功能的排斥性，更傾向于遠(yuǎn)離表面。表面的這種排斥或不結(jié)垢的性質(zhì)確保了弱的蛋白質(zhì)-表面相互作用不會(huì)在能量格局中為蛋白質(zhì)重新折疊引入額外的障礙。在gamma-APS表面上，GFP與附近的“粘性”或結(jié)垢–NH2官能團(tuán)之間存在吸引人的非特異性相互作用。變性后，與粘性環(huán)境的這種非特異性相互作用有望增加，從而有效地在能量格局中引入了無(wú)法克服的障礙，從而使蛋白質(zhì)重新折疊。Cu2 + / PEG表面對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行芯片重折疊的能力為許多潛在應(yīng)用打開了大門，例如，直接在芯片上生成蛋白質(zhì)微陣列，從重組蛋白質(zhì)中去除包涵體等。這些涂層可供選擇在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片，蓋玻片和硅片上。我們的客戶已成功將Cu2 + / PEG表面應(yīng)用于各種應(yīng)用，包括蛋白質(zhì)傳感器，蛋白質(zhì)微陣列，單分子光譜，生物原子力顯微鏡和其他生物物理研究。即將推出：Cu2 + / PEG表面的三維（3D）版本正在開發(fā)中。微孔3D涂層提供的大表面積允許高聚His標(biāo)簽探針?lè)肿拥母哓?fù)載。這是檢測(cè)極低濃度生物標(biāo)志物的理想選擇。

圖4.在三個(gè)表面上變性（De）和再折疊（Re）循環(huán)前后的6xHis-GFP熒光顯微鏡圖像：（a）Cu2 + / PEG；（b）Cu2 //γ-APS；（c）γ-APS。變性涉及將6xHis-GFP涂層的表面浸入pH = 3.5的緩沖溶液中，而重新折疊對(duì)應(yīng)于將樣品與含有1xPBS，20％蔗糖和10％甘油的pH = 8.1的緩沖溶液一起孵育。

閱讀使用我們的Cu2 +表面發(fā)表的文章：蛋白質(zhì)組學(xué)，2005，5，416；蛋白質(zhì)組學(xué)，2007，7，1771; 自然方法，2008，5，507; BMC Biotech。，2009，1.等。